非典型和间变性脑膜瘤占所有脑膜瘤的百分之二十。由于其复发倾向，它们与不良后果相关。虽然手术和放射是一线治疗，但尚未确定有效的全身医学治疗。蛋白磷酸酶是遍在表达的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，参与细胞周期调节和脱氧核糖核酸修复。在这里，研究人员检查了的放射增敏作用，三种人源永生化脑膜瘤细胞系用于研究放射增敏潜力在间变性脑膜瘤中的蛋白磷酸酶抑制剂在体外评估通过克隆形成测定，免疫荧光，细胞周期分析和蛋白质表达的存活分数。通过使用颅内原位异种移植小鼠模型在体内验证了与放射治疗组合的抗肿瘤作用。在放射治疗之前用抑制药理学蛋白磷酸酶增强了脑膜瘤细胞的放射敏感性并降低了克隆形成测定中的存活分数。增加脱氧核糖核酸双链断裂，有丝分裂突变细胞死亡和细胞周期停滞在受照射的脑膜瘤细胞中。
　　 脑膜瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。尽管大多数是良性病变，被分类为世界健康组织非典型或间变性。护理标准包括最大手术切除，然后是亚完全切除的肿瘤的放射。不幸的是，尽管进行了积极的治疗，非典型和间变性脑膜瘤往往会复发。进行性肿瘤通常难以进一步治疗并且通过局部侵入产生神经系统后遗症，或者在肿瘤的情况下，转移至骨或肺。迄今为止，药物治疗在治疗脑膜瘤方面取得了有限的成功。虽然已经研究了多种抗肿瘤药物，但在回顾性研究中，只有抗血管生成药物如贝伐单抗才能见到有限的结果。然而，在将这些药物推荐为标准治疗之前，需要在前瞻性对照试验中确认其临床有效性。鉴于没有进一步手术或放射治疗选择的患者缺乏有效治疗，迫切的临床需要开发新疗法以扩展针对这些难以治疗的肿瘤的医疗设备。由于放射治疗是手术切除后的主要辅助治疗，因此添加增强标准放射治疗效率的放射增敏剂是一种有吸引力的策略。
　　 蛋白磷酸酶是一种普遍存在的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，参与广泛的调节细胞功能，包括细胞存活，细胞凋亡，有丝分裂和脱氧核糖核酸损伤反应。特别是，蛋白磷酸酶已被证明在修复化学疗法或辐射诱导的脱氧核糖核酸损伤中起关键作用。因此，抑制蛋白磷酸酶可能进一步恶化癌细胞中的脱氧核糖核酸损伤并加速不适当地进入。在设置中电离辐射，这可能导致复杂的无序复制和细胞死亡。然而，尽管蛋白磷酸酶是使肿瘤细胞对辐射效应敏感的有吸引力的靶标，但蛋白磷酸酶的抑制剂未经批准。已建立的化学抑制剂，如冈田酸和斑，是有毒的，临床应用有限。蛋白磷酸酶抑制剂是一种新型的蛋白磷酸酶小分子抑制剂。在完成的研究中，蛋白磷酸酶抑制剂在患有进行性实体瘤的成年患者中具有良好的耐受性。在许多临床前研究中，蛋白磷酸酶抑制剂是辐射的有效敏化剂，包括胰腺癌和成胶质细胞瘤。然而，尚未研究蛋白磷酸酶抑制在脑膜瘤中的作用，并且没有研究检查在颅内肿瘤模型中的放射增敏作用。因此，研究人员选择在临床前环境中研究在间变性脑膜瘤中的放射增敏潜力。三种永生化的脑膜瘤细胞系，用于体外研究。细胞用于颅内颅底异种移植物模型。除了防止脱氧核糖核酸修复外，蛋白磷酸酶抑制还降低了信号转导子和转录激活因子的激活。转录激活因子在肿瘤发生中的作用已在许多不同类型的癌症中得到广泛研究。在脑膜瘤中，与正常硬脑膜相比，肿瘤中转录激活因子的组成性激活更大。其表达也与肿瘤分级表达相关，提示其在脑膜瘤发病机制中起关键作用。因此，研究人员假设蛋白磷酸酶抑制剂也可以使转录激活因子失活并增强辐射诱导的细胞死亡。
　　 将所有三种细胞系维持在完全培养基中，特别是含有胎牛血清的改良培养基并补充谷氨酰胺，丙酮酸钠和青霉素。在用完全蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒片增强的裂解缓冲液中提取全细胞沉淀的蛋白质，并通过离心超声处理和纯化。蛋白质测定试剂盒蛋白质测定试剂盒用于定量上清液中的蛋白质。将细胞悬浮液接种到组织培养板中。在开始治疗方案之前，将细胞给予以附着。在室温之前给予蛋白磷酸酶抑制剂预处理。接种后几天，将菌落用结晶紫溶液染色。计数具有超过细胞的集落。通过使用克隆形成存活计算软件将存活的级分拟合到线性二次模型中来获得细胞存活曲线。该敏增强比计算为在不存在蛋白磷酸酶抑制剂的情况下实现存活，需的辐射剂量与在蛋白磷酸酶抑制剂存在下实现的比率。使细胞在培养皿中生长至汇合并如所示进行处理。在放射治疗之前给予蛋白磷酸酶抑制剂。洗涤细胞两次，并在补充有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中在冰上裂解。将细胞裂解物超声处理，然后以最大速度离心。根据制造商的说明，用蛋白磷酸酶磷酸酶测定试剂盒测定含有总细胞蛋白的上清液。实验一式三份进行，数据表示为相对于对照的相对蛋白磷酸酶活性的百分比平均值。
　　 进行灶的免疫荧光细胞化学染色。细胞在室玻片中生长，并在施用或假辐射之前暴露于蛋白磷酸酶抑制剂。用多聚甲醛固定细胞，细胞核用复染中。用抗褪色溶液固定盖玻片，并在荧光显微镜上检查细胞。每种条件下至少细胞定量灶。碎片核的存在用于描绘经历有丝分裂灾难的细胞。细胞在如上所述的相同处理条件下在室载玻片上生长，在室温下给予蛋白磷酸酶抑制剂处理组。用甲醇固定细胞用封闭，并在用小鼠抗微管蛋白抗体染色过夜，然后在室温下用山羊抗小鼠-德克萨斯红抗体染色。然后用对细胞核进行复染色。用抗褪色溶液固定盖玻片，并在荧光显微镜上观察细胞。手动计数细胞，并且定义经历有丝分裂灾难的细胞的标准是存在更多个片段化细胞核的叶。对于每种病症，评分至少细胞。将细胞接种在孔板上。处理后，使用流式细胞术测定试剂盒根据制造商的说明固定细胞并透化。简言之，在进行反应之前，将细胞用脉冲标记。然后将细胞固定并透化，然后用切割的和切割的抗体染色小时，然后用适当的二抗染色。最后，将细胞在中孵育。然后通过流式细胞术分析细胞。使用完成数据分析。所有数据均以百分比表示。表达荧光素酶的通过用慢病毒转导产生，用萤火虫荧光素酶和标记细胞。将转导的细胞维持在嘌呤霉素选择中。在植入之前，进行以确保至少的阳性细胞。
　　 所有动物研究均按照动物护理和使用指南中概述的原则和程序进行，并由国立卫生研究院的动物护理和使用委员会批准。先前描述了颅底脑膜瘤模型。简而言之，为了植入肿瘤，使用龄雌性裸鼠。将鼠标头固定在立体定位装置中。用抗菌溶液清洁头骨上的皮肤。在枕骨和前额之间形成纵向切口。使用高速钻头将前额骨处的前孔和外侧的钻孔插入前囟。将细胞重悬于培养基中并吸入注射器中，该注射器安装在立体定向框架上。立体定向地，针穿过钻孔并缓慢地落到中间窝的地板上。在注射细胞悬浮液，然后在取出针头。该过程有助于防止细胞沿针道泄漏。植入后，动物设施工作人员每天独立监测动物。当动物出现神经系统症状或体重峰值减少时，对动物实施安乐死。将小鼠在含有异氟烷的氧增强空气混合物的室中麻醉。然后给动物腹膜内注射的荧光素。使用成像站对动物成像。使用活体图像软件定义感兴趣区域，并且记录光子中的总生物发光以监测肿瘤负荷。注射细胞几天后，将总生物发光信号大于已建立肿瘤的小鼠随机分成，盐水，蛋白磷酸酶抑制剂处理组，放射治疗处理组和组合。在肿瘤植入后给予治疗。蛋白磷酸酶抑制剂治疗组中的小鼠注射蛋白磷酸酶抑制剂。给出了四种治疗方法。在联合治疗组中，在放射治疗之前约给予蛋白磷酸酶抑制剂。动物被限制在国家癌症研究所放射生物学分部定制的铅夹具中。在存活终点处死小鼠用于组织学分析。
　　 为了研究蛋白磷酸酶的小分子抑制剂蛋白磷酸酶抑制剂在间变性脑膜瘤治疗中的应用，研究人员首先测试了蛋白磷酸酶抑制剂对体外三种不同脑膜瘤细胞系细胞存活率的影响。在蛋白磷酸酶抑制剂处理进行测定。虽然随着蛋白磷酸酶抑制剂浓度的增加存在剂量依赖性的细胞生长抑制，但仅在高剂量的蛋白磷酸酶抑制剂中观察到细胞毒性作用。基于在大鼠中进行的药代动力学研究，可达到的最大值当以先前临床前研究中使用的耐受剂量给予时，蛋白磷酸酶抑制剂的血浆浓度可能。因此，作为单一疗法的蛋白磷酸酶抑制剂不太可能有效治疗间变性脑膜瘤。因此，研究人员在随后的体外研究中选择的剂量来检查蛋白磷酸酶抑制剂对致敏细胞对辐射效应的影响。研究人员使用细胞进行克隆形成测定。不使用细胞，因为它们不形成集落。为了确定蛋白磷酸酶抑制剂是否增强细胞对放射治疗的敏感性，进行了克隆形成测定。克隆形成测定显示，与单一处理组相比，组合处理显着减少了菌落。这些结果令人信服地证明蛋白磷酸酶抑制剂在体外充当抗脑膜瘤细胞的放射增敏剂。
　　蛋白磷酸酶已被证明参与了辐射诱导的脱氧核糖核酸损伤后介导的细胞周期检查点的激活。与其他细胞类型的早期报道一致，辐射诱导蛋白磷酸酶活性增加。在辐射前用预处理消除了蛋白磷酸酶活性的增加。为了评估蛋白磷酸酶抑制对脱氧核糖核酸损伤和修复的影响，使用细胞中的免疫荧光定量表达作为脱氧核糖核酸双链断裂的量度。将细胞用蛋白磷酸酶抑制剂预处理，然后接受放射治疗。处理后将染色每个核的焦点的平均数量是手动量化的。仅蛋白磷酸酶抑制剂没有引起水平的显着变化;如预期的辐射在增加水平。然而，联合治疗显着增强了所有细胞系中的表达量，表明蛋白磷酸酶抑制损害了细胞修复。辐射诱导的脱氧核糖核酸双链断裂。
　　 为了评估蛋白磷酸酶抑制剂的放射增敏作用是否通过增加的细胞凋亡介导，研究人员在处理后通过流式细胞术测量切割的和切割的的表达。在所有三种细胞系中，与单独的放射治疗相比，组合中的凋亡细胞没有显着增加。以前的研究表明，蛋白磷酸酶抑制剂治疗可以促进有丝分裂灾难，这是一种特殊形式的细胞死亡不同于细胞凋亡，其特征在于异常有丝分裂象的出现。为了评估蛋白磷酸酶抑制剂和/或辐射诱导的有丝分裂灾难的程度，在处理后通过免疫荧光定量有丝分裂灾难中细胞的相对数量。在所有三种细胞系中，与单独的放射治疗相比，有丝分裂灾难细胞的组合百分比显着更高。因此，研究人员得出结论，蛋白磷酸酶抑制剂和放射组合促进的细胞死亡的主要形式是通过有丝分裂灾难而不是细胞凋亡。
　　 为了进一步研究介导的放射增敏的潜在机制，进行细胞周期分析以证明蛋白磷酸酶抑制对细胞周期控制的影响。蛋白磷酸酶已被证明是某些癌细胞系中滞所必需的，并且在脱氧核糖核酸损伤情况下蛋白磷酸酶的抑制可诱导细胞在期的积累。在处理后进行流式细胞术以评估脑膜瘤细胞的细胞周期分布。仅蛋白磷酸酶抑制剂在细胞分布没有显着变化。然而，当用蛋白磷酸酶抑制剂和放射治疗组合处理时，与单一处理和对照细胞相比，细胞的比例显着更高。该结果与先前在其他肿瘤类型中的发现一致，其中蛋白磷酸酶抑制导致由于持续的未修复的脱氧核糖核酸损伤导致中的细胞增加。以前的工作表明抑制蛋白磷酸酶可能通过调节丝氨酸磷酸化导致失活。已发现初级活化磷酸化位点与丝氨酸磷酸化呈负相关。在蛋白磷酸酶抑制剂处理，使用夹心酶联免疫吸附测定法定量的磷酸化。用蛋白磷酸酶抑制剂处理，磷酸化存在剂量依赖性降低。在蛋白磷酸酶抑制剂中，与所有细胞系中的对照相比，活化被抑制。进一步确认下调在所有细胞系中，用轴对三种下游靶标的蛋白质表达进行免疫印迹检测。用蛋白磷酸酶抑制剂处理以剂量依赖性方式显着抑制所有三个下游靶标。为了证实蛋白磷酸酶抑制剂在体内的放射增敏作用，如前所述使用萤火虫-萤光素酶标记的细胞系的颅内原位颅底脑膜瘤小鼠模型。肿瘤植入后将具有确定肿瘤的小鼠，在通过总生物发光测量的肿瘤负荷在所有四组之间是相似的。随机化后，肿瘤生长在肿瘤植入评估。通过总生物发光测量，放射治疗和组合组之间存在肿瘤生长减少的趋势。尽管与对照相比，放射治疗治疗显着增加了中位生存期，但与单独使用放射治疗相比，向放射治疗中添加蛋白磷酸酶抑制剂显着增加了中位生存期，证明蛋白磷酸酶抑制剂的添加使得通过中值存活率测量的放射治疗的存活益处加倍。处死小鼠的大体组织学检查证实了植入肿瘤的颅底位置。染色还显示组织学发现与具有高细胞性和脑侵袭的侵袭性间变性脑膜瘤一致。
　　 在这项研究中，研究人员展示了蛋白磷酸酶抑制剂在使用颅底脑膜瘤的侵袭性正交异生异种移植物在体外和体内对间变性脑膜瘤治疗中的放射治疗效果的敏感性。虽然在几种肿瘤类型的临床前研究中已经提出蛋白磷酸酶抑制作为放射增敏的潜在策略，包括鼻咽癌，和胶质母细胞瘤。据研究人员所知，这是第一项证明其在脑膜瘤或任何颅内肿瘤模型中的放射增敏潜力的研究。研究人员已经证明单独的蛋白磷酸酶抑制剂对于脑膜瘤生长具有有限的效用，这种浓度在生理上可能是无法实现的。然而，研究人员证实蛋白磷酸酶抑制剂抑制了放射治疗诱导的蛋白磷酸酶活性增加，这对介导辐射诱导的脱氧核糖核酸损伤的同源重组修复至关重要。反过来，蛋白磷酸酶抑制剂和放射治疗组合显着增强病灶保留，这是更多未修复的脱氧核糖核酸损伤的标志。与早期报道一致，蛋白磷酸酶抑制与放射治疗联合导致检查点失活，微管稳定性降低，导致有丝分裂突变，一种特定形式的细胞死亡。研究人员观察到细胞周期的期显着增加，并且组合使有丝分裂灾难显着增加。蛋白磷酸酶抑制剂似乎没有增强凋亡细胞死亡因为单独的放射治疗和组合之间细胞没有显着差异，这表明组合治疗的增强的细胞毒性主要是由有丝分裂灾难细胞死亡增加引起的。在研究人员使用细胞的体内颅底脑膜瘤模型中，肿瘤是侵袭性的，并且通过沿着蛛网膜平面和侵入周围脑来显示恶性脑膜瘤的组织学特征。在没有治疗的情况下，使用总生物发光测量作为肿瘤大小的代表研究人员已经证明，与单独的放射治疗相比，联合组中肿瘤负荷减少的趋势。然而，由于生长轨迹的高度变化，差异不显着，尽管各组之间基线肿瘤负荷随机化良好。在生存分析中，与单独使用放射治疗相比，联合治疗确实显着增加了中位生存期，放射治疗与对照相比具有相同的生存获益。这是一个值得注意的结果，因为它表明蛋白磷酸酶抑制剂可以在积极的正交各向异性肿瘤模型中使放射治疗的存活益处加倍。
　　 除了对脱氧核糖核酸修复和细胞周期控制的影响外，蛋白磷酸酶抑制也被证明可以抑制的激活，是一种在许多癌症类型中组成性激活的关键转录因子。激活也被认为在诱导上皮-间质转化中发挥重要作用，使肿瘤细胞转变为对化疗或放射疗法具有转移性。抑制已被证明可逆转间质转化和放射抗性。在脑膜瘤中，相对于正常硬脑膜过度激其表达与肿瘤分级和表达相关。研究人员证明了蛋白磷酸酶抑制剂可以减少的活化，这反映在的初级激活位点的磷酸化降低。为了确认轴的信号传导减少，还显示几个下游靶标用蛋白磷酸酶抑制剂下调，蛋白磷酸酶，是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不直接调节，而是已知在使二级磷酸化位点去磷酸化。抑制蛋白磷酸酶诱导重新分布到细胞质和的功能抑制。在该研究中未评估蛋白磷酸酶介导的抑制对脑膜瘤细胞中的放射增敏作用的相对贡献。该研究的主要限制是在体外和体内实验中依赖永生化细胞系。虽然本研究中的三种细胞系广泛用于脑膜瘤研究并且具有良好的遗传特征，但研究人员的实验结论仍然容易出现使用人类癌细胞系的常见缺陷。然而，这在很大程度上得益于多种细胞系的一致结果以及其他肿瘤类型的类似发现。采用裸鼠与异种移植还排除了放射治疗和蛋白磷酸酶抑制剂的效果在动物与主管研究的免疫系统。最近的一项研究发现，抑制免疫细胞中的蛋白磷酸酶可以通过激活来增强抗肿瘤免疫反应。研究人员的研究未能显示蛋白磷酸酶抑制剂治疗对适应性免疫介导的抗肿瘤反应的影响。然而，缺乏易于获得的脑膜瘤的转基因或同系模型将使得这样的研究难以实现。总之，研究人员已经证明了令人信服的临床前证据，即蛋白磷酸酶的新型抑制剂蛋白磷酸酶抑制剂可以通过多种机制有效地使脑膜瘤细胞对辐射的治疗效果敏感。最近的临床试验显示蛋白磷酸酶抑制剂的这些发现和有利的毒性特征支持了间变性脑膜瘤患者并发蛋白磷酸酶抑制剂和放疗的进一步临床研究。